3 PMMoV 檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用情況
目前，常用的植物病毒檢測(cè)方法包括指示植物法、電子顯微鏡技術(shù)、以外殼蛋白為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)和以核酸為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)。前2 種方法檢測(cè)周期較長(zhǎng)，不適合田間大量樣品的檢測(cè)，目前生產(chǎn)中常用的檢測(cè)方法是后2 種，在以外殼蛋白為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的是酶聯(lián)免疫技術(shù)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)，以核酸為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)中應(yīng)用廣泛的是反轉(zhuǎn)錄PCR(ReversetranscriptionPolymerase Chain Reaction，RT-PCR)以及核酸分子雜交技術(shù)(Nucleotide molecular hybridization)。
3. 1 ELISA 技術(shù)ELISA 是一種采用固相(主要為聚苯乙烯酶聯(lián)板)吸附，將免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)有機(jī)結(jié)合在一起的方法，其基本原理是以酶催化的顏色反應(yīng)指示抗原抗體的結(jié)合。ELISA 方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、安全、快速且結(jié)果容易觀察，適于大量樣品的檢測(cè)，目前已被廣泛應(yīng)用于植物病毒檢測(cè)。ELISA 包括直接法、間接法、雙夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、酶抗酶法、雙抗體夾心法6 種，最常用的是雙抗體夾心法和間接法。2004 年Ikegashira 等采用DAS-ELISA方法對(duì)甜椒地土壤中的PMMoV 進(jìn)行了檢測(cè)。2006 年Wang 等采用DAS-ELISA 方法對(duì)采自北京、寧夏惠農(nóng)、河北保定地區(qū)的165 個(gè)樣品進(jìn)行了PMMoV 檢測(cè)。2007 年張永江等采用三抗體夾心酶聯(lián)免疫技術(shù)(TAS-ELISA)和RT-PCR 技術(shù)對(duì)3 份進(jìn)口包被種衣劑的辣椒種子進(jìn)行了檢測(cè)，建立了快速靈敏檢測(cè)體系。
3. 2 RT-PCR 技術(shù)PCR 是1985 年由Saik 等發(fā)明的一種體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA 序列的方法，該方法是發(fā)展和普及最迅速的分子生物學(xué)技術(shù)之一。PCR 技術(shù)發(fā)明后，不斷衍生出許多新技術(shù)，RT-PCR 就是其中的一種。PMMoV 為RNA 病毒，RT-PCR 可將PMMoV 基因組RNA 中的特異性片段首先利用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，然后利用PCR 技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是:①靈敏度高;②特異性強(qiáng)(研究表明，其產(chǎn)物的堿基錯(cuò)配率一般只有2 × 10 － 4 );③可用于株系鑒定(同種病毒不同株系間具有免疫交叉反應(yīng)，血清學(xué)方法檢測(cè)受到限制，但基因組某些區(qū)域存在很大差異，所以PCR 可用于株系鑒定);④安全可靠，無(wú)放射性危險(xiǎn)。2004年黃粵等建立了檢測(cè)PMMoV 的RT-PCR 技術(shù)體系。
3. 3 核酸分子雜交技術(shù)該技術(shù)是用特定的已知核酸片段與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，進(jìn)而檢測(cè)核酸樣品中特定基因序列的方法。最初的核酸雜交試驗(yàn)采用放射性同位素標(biāo)記探針，近幾年來(lái)常采用生物素或地高辛標(biāo)記的非放射性探針?lè)肿?更安全，壽命更長(zhǎng)，與放射性標(biāo)記的探針一樣靈敏和實(shí)用)。Wang 等利用地高辛標(biāo)記的cDNA 探針、RT-PCR 以及雙抗體夾心ELISA 3 種方法對(duì)PMMoV 的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，RT-PCR 靈敏度最高，地高辛標(biāo)記的核酸斑點(diǎn)雜交方法靈敏度次之，雙抗體夾心ELISA 靈敏度最低。
目前有關(guān)PMMoV 的研究十分有限，主要包括:①確定了PMMoV 的CP 是辣椒植株中L 抗性基因的激發(fā)子，并闡明CP 基因中某些核苷酸與激發(fā)辣椒中L 抗性密切相關(guān);②PMMoV致弱株系的分離及與致弱相關(guān)基因的確定，目前已闡明126 /183 kDa 中的IR 區(qū)是主要影響PMMoV 癥狀表現(xiàn)的區(qū)域;③3′端非編碼區(qū)是PMMoV 的主要致病域。目前，北京附近地區(qū)發(fā)生的PMMoV-CN 的全基因組序列已為人們所知。進(jìn)一步研究PMMoV 對(duì)防止該病毒的擴(kuò)散及辣椒病毒病的有效防治具有十分重要的意義。