2 天蠶素抗菌肽CAD
2.1 天蠶素抗菌肽
天蠶素抗菌肽(Cecropins) 屬于陽離子抗菌肽家族中重要的一族，最早由瑞典科學(xué)家B o m a n  等于1980 年用陰溝通桿菌及大腸桿菌誘導(dǎo)惜古比天蠶(Hy a l o p h o r ac e c r o p i a ) 蛹后發(fā)現(xiàn)。天蠶素抗菌肽是世界上發(fā)現(xiàn)最早，也是研究最徹底、效果最明顯的一類抗菌肽，是昆蟲非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，一般由31 ～ 39 個氨基酸組成，分子量約為3.5k D a ～ 4k D a 左右，其分子結(jié)構(gòu)相對保守，主要由α 螺旋構(gòu)成，屬于α 螺旋類抗菌肽。這類抗菌肽熱穩(wěn)定性好，無免疫原性，抗菌能力強(qiáng)，能有效抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長。研究發(fā)現(xiàn)天蠶素抗菌肽對一些真核細(xì)胞不具毒性作用，如家蠶cecropin A 和cecropin B 能夠抑制并殺死白色念珠菌，但對人體細(xì)胞株J u r k a t 沒有毒性，即使在高濃度下，也不會使真核生物的紅血球發(fā)生溶解破裂。這些結(jié)構(gòu)和功能上的特性使天蠶素類抗菌肽成為抗菌肽應(yīng)用和研究的重要對象。
2.1.1 天蠶素抗菌肽的構(gòu)效關(guān)系 由于Cecropin 分子結(jié)構(gòu)相對保守，一般為α 螺旋- 鉸鏈-α 螺旋結(jié)構(gòu)，N 末端雙親α 螺旋；C 末端疏水α 螺旋，這種N 末端雙親α螺旋結(jié)構(gòu)對于天蠶素抗菌肽發(fā)揮作用非常重要。F u 和Srisailam 等研究表明，α 螺旋對抗菌肽的殺菌活性強(qiáng)弱起著重要作用，同時其殺菌能力的強(qiáng)弱還與殺菌過程中Cecropin 在脂質(zhì)表面聚攏的濃度和分子方向有關(guān)。
2.1.2 天蠶素抗菌肽的作用機(jī)制 目前，對于Cecropins的抗菌機(jī)制尚無定論，但普遍認(rèn)為是通過破壞質(zhì)膜脂質(zhì)機(jī)制造成，即其通過自身陽離子所攜帶的正電荷與帶負(fù)電荷的細(xì)菌脂膜之間的電荷作用，插入其中擾亂磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞脂膜去極化并在表面形成孔洞，造成細(xì)菌細(xì)胞因內(nèi)容物外泄而死亡。這一過程分為兩個階段：Cecropins 與脂膜之間的相互作用和Cecropins 對脂膜的破壞。Hiromi 等研究發(fā)現(xiàn)，不同的天蠶素類抗菌肽可能具有不同的破壞質(zhì)膜機(jī)制。2.1.3 天蠶素抗菌肽雜合肽 為了尋找更高效低毒的抗菌肽，使通過改造后的天然抗菌肽分子更小、活性更高，同時減少對真核生物的毒性及降低生產(chǎn)成本，研究者通過互聯(lián)網(wǎng)和計算機(jī)軟件比較分析了大量有關(guān)抗菌肽的序列和空間結(jié)構(gòu)，根據(jù)分析結(jié)果設(shè)計具有更好抗菌活性的抗菌肽分子，使這些重組基因抗菌肽與人工設(shè)計的抗菌肽具有活性更高、抗菌譜更廣、熱穩(wěn)定性好、沒有抗原性、沒有溶血作用等特點(diǎn)。如Fink 等研究發(fā)現(xiàn)，將CecropinA 和Cecropin D 的序列片段用固相法化學(xué)合成的雜合肽CAD，其抗菌活性高于天然的Cecropins 類抗菌肽，且抗菌譜也有所增加。Wachinger 等研究發(fā)現(xiàn)，天蠶素和蜂毒素的雜合肽可以在亞毒性濃度下抑制艾滋病毒HI V -1的基因表達(dá)，從而減少HI V -1 的增殖。但由于人工固相合成價格昂貴，不能進(jìn)入實(shí)用領(lǐng)域，因此，雜合肽作為一類潛在的新型抗菌肽需要進(jìn)一步研究。目前，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)在雜合肽的基因工程方面做了很多研究工作，為雜合肽的開發(fā)和應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。
2.2 天蠶素抗菌肽CAD
2.2.1 天蠶素抗菌肽CAD 簡介 天蠶素抗菌肽CAD(Cecropin A and D，CAD) 是對Cecropins 類抗菌肽改造過程中，通過氨基酸替換的方法，設(shè)計合成的由含正電荷較高的Cecropin A(1-11) 片段和疏水性較強(qiáng)的Cecropin D(12-37) 片段構(gòu)成的雜合肽。CAD 由37 個氨基酸組成，分子量為3.8k D a，其二級結(jié)構(gòu)中78.38% 為α 螺旋，其余為無規(guī)則卷曲。其中Cecropin A(1-11) 片段被認(rèn)為能形成典型的α 螺旋結(jié)構(gòu)。研究表明CAD對被測試的6 種細(xì)菌的抗菌活性分別為天蠶素D 抗菌活性的5 ～ 55 倍，與天蠶素A 相比，其抗菌活性也略高。在抗枯草芽孢桿菌上，CAD 的活性比天蠶素A 高6 倍左右，增加的活性源于C A D 在序列中部和羧基端同天蠶素D 具有相類似的結(jié)構(gòu)，即比天蠶素A、B 更強(qiáng)的螺旋程度和羧基末端更強(qiáng)的疏水性。C A D 顯著的特征是能夠快速在人工膜上形成電壓依賴型離子通道的能力。目前該雜合肽C A D 已由國家飼料工程技術(shù)研究中心通過基因工程方法在枯草桿菌表達(dá)載體中表達(dá)獲得，表達(dá)產(chǎn)物活性高、理化特性好，且抗菌特性比目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報導(dǎo)的具有優(yōu)勢。通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)順利解決了抗菌肽產(chǎn)品生產(chǎn)成本昂貴這一限制其廣泛應(yīng)用的瓶頸，在獸藥和飼料添加劑領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
2.2.2 由枯草芽孢桿菌作為C A D 表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢 用大腸桿菌作為表達(dá)載體會形成以不可溶狀態(tài)內(nèi)含體形式存在的緊湊型多肽分子，這種內(nèi)含體蛋白是喪失生物學(xué)活性的，如果要恢復(fù)其部分活性需要經(jīng)過復(fù)雜的溶解、再折疊和純化過程。用酵母表達(dá)系統(tǒng)如畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)可以解決這些翻譯后加工問題，但是隨后的分批培養(yǎng)過程卻需要耗費(fèi)大量的成本，這使酵母表達(dá)系統(tǒng)作為抗菌肽的表達(dá)系統(tǒng)也不現(xiàn)實(shí)�？莶菅挎邨U菌表達(dá)系統(tǒng)不會存在上述兩種表達(dá)系統(tǒng)作為表達(dá)載體時出現(xiàn)的問題，特別是對異種蛋白的分泌上。由枯草芽孢桿菌表達(dá)的外源蛋白通常以具有生物活性的形式存在，且其下游的純化過程被極大簡化。該表達(dá)系統(tǒng)還有個優(yōu)點(diǎn)，在這種理論上較高表達(dá)量的情況下，表達(dá)產(chǎn)物不會在表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)累積，為繼續(xù)培養(yǎng)和生產(chǎn)提供了可能，進(jìn)而極大的簡化了目的蛋白的表達(dá)過程和降低生產(chǎn)成本。
2.2.3 天蠶素抗菌肽CAD 穩(wěn)定性 伍小松 等對天蠶素抗菌肽C A D 熱穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明，天蠶素類抗菌肽C A D 在37℃～ 55℃時具有較高活性，而人和畜禽的體溫接近40℃，這滿足其發(fā)揮活性的溫度條件。此外，該產(chǎn)品耐熱性和耐酸性效果較佳，在100℃水浴15mi n 后或pH為1 時仍表現(xiàn)出對金黃色葡萄球菌的抗性。在被胃蛋白酶和胰蛋白酶作用后，CAD 仍然具有活性。
2.2.4 天蠶素抗菌肽C A D 安全性 譙仕彥等( 資料未發(fā)表) 研究了天蠶素抗菌肽CAD 的安全性，結(jié)果表明：對大、小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)的LD50 ＞ 5000mg/kg 體重；小鼠精子畸形和骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果均為陰性；對大鼠無亞慢性毒性；無明顯生殖毒性和胚胎毒性；無慢性毒性和致癌性。3 天蠶素抗菌肽CAD 在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用
3.1 對大鼠生長性能和免疫功能的影響
    陳香 等研究表明在大鼠日糧中添加75mg/kg 的天蠶素抗菌肽，可提高大鼠平均日增重和日采食量，并可降低料肉比。在試驗(yàn)第14d 時，抗菌肽促進(jìn)小鼠脾臟和胸腺的生長發(fā)育，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)是機(jī)體脾臟和胸腺發(fā)育程度的一個重要反映，說明天蠶素抗菌肽具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。王阿榮 等也發(fā)現(xiàn)，日糧中添加天蠶素抗菌肽能提高斷奶仔豬的機(jī)體免疫性能。
3.2 對豬生長性能的影響
    陳香 等研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬日糧中用250m g /kg 的天蠶素抗菌肽CAD 替代10% 的硫酸抗敵素300mg/k g 和10% 的桿菌肽鋅1500m g / k g 的抗生素組合，斷奶仔豬日增重提高5.4% ～ 9.7%，飼料轉(zhuǎn)化效率改善14% ～ 18%，腹瀉率降低30% 以上。說明斷奶仔豬日糧中使用天蠶素能起到顯著促生長和保健作用。王阿榮 等在仔豬日糧中添加天蠶素抗菌肽研究發(fā)現(xiàn)，天蠶素抗菌肽能提高北京原種黑豬斷奶仔豬的生產(chǎn)性能和機(jī)體免疫性能。雷東風(fēng) 等研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加天蠶素抗菌肽能增加斷奶仔豬平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率。李波 等在母豬產(chǎn)前30d 和產(chǎn)后21d 飼糧中添加400m g / k g 的天蠶素發(fā)現(xiàn)母豬的繁殖性能和仔豬的生長性能等指標(biāo)均高于以抗生素作為添加劑的對照組。試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加天蠶素組活仔率提高5.6%，死胎率減少74%，仔豬腹瀉率下降47%。
3.3 對肉雞生長性能的影響
    單達(dá)聰 等研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加天蠶素抗菌肽能提高艾維茵肉雞增重率(1.67% , P <0.05) 和采食量(5.46% )，降低料肉比(1.77% )。李波 等研究發(fā)現(xiàn)在肉雞日糧中添加天蠶素抗菌肽可提高肉雞的生產(chǎn)性能和抗病能力。在存活率方面，飼料中添加天蠶素抗菌肽組比對照組提高了0.26%。在料肉比方面，試驗(yàn)組比對照組降低了2.46%。即添加天蠶素抗菌肽的試驗(yàn)組上述指標(biāo)明顯高于抗生素作為添加劑的對照組。
3.4 對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物生長性能的影響
    王冬冬 等研究發(fā)現(xiàn)，添加100m g / k g 天蠶素抗菌肽對鯉魚末重和特定生長率具有顯著的提高作用(P＜ 0.05)。黃滄海 等研究顯示，在羅非魚日糧中添加100m g / k g 的天蠶素抗菌肽，特定生長率可提高約3%，其它指標(biāo)與添加250mg/kg 的8% 黃霉素?zé)o顯著性差異。
4 展望
    抗菌肽具有新的抗生素類所需要的很多特性。它可以作為單獨(dú)的抗菌劑使用，也可以與傳統(tǒng)的抗生素聯(lián)合使用發(fā)揮協(xié)同作用，作為免疫調(diào)制劑或中和內(nèi)毒素，因此抗菌肽的臨床應(yīng)用潛力很大。盡管抗菌肽在殺滅一些敏感病菌時效果不如特定的傳統(tǒng)抗生素好，但其優(yōu)勢之一就是能有效地作用于多重耐藥性菌，其殺菌作用十分迅速且具有復(fù)雜的細(xì)菌胞內(nèi)作用靶點(diǎn)，而不易形成耐藥性。經(jīng)過人工改造的天蠶素抗菌肽C A D 較原有天然天蠶素抗菌肽具有穩(wěn)定性更好、抗菌譜更廣、活性更高的優(yōu)點(diǎn)。且作為飼料添加劑而言，以工程菌工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽，可大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低且不受季節(jié)和氣候變化等外在環(huán)境的影響。同時抗菌肽產(chǎn)品具有廣譜抗菌作用，對畜禽具促生長、保健和治療疾病的功能，屬無毒副作用、無殘留、無致細(xì)菌耐藥性的一類環(huán)保型制劑，對畜牧生產(chǎn)，飼料加工的發(fā)展都有巨大的推動作用。要進(jìn)一步推動抗菌肽的應(yīng)用，還必須深入研究以下問題：①抗菌肽在生命體特別是高等生命體防御系統(tǒng)中的準(zhǔn)確定位以及生物模式；②抗菌肽表達(dá)水平與各種疾病的相關(guān)性；③抗菌肽構(gòu)效關(guān)系和作用機(jī)制；④抗菌肽作為藥物制劑時的藥代動力學(xué)相關(guān)問題；⑤雜合抗菌肽大規(guī)模高表達(dá)的生產(chǎn)方法。隨著對抗菌肽更深入的研究和基因工程的進(jìn)展及生化技術(shù)的提高，不久的將來抗菌肽的臨床應(yīng)用可以部分減少甚至取代抗生素的使用，給人類帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

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